Nature Communications|bulk+scRNA+TCR-seq，揭秘肝内胆管癌联合治疗耐药关键（附Python代码）

简佐义的博客

644人浏览 · 2026-02-15 20:00:20

简佐义的博客 · 2026-02-15 20:00:20 发布

为何同样接受GOLP联合治疗，有些肝内胆管癌患者疗效显著，有些却收效甚微？肿瘤微环境中的免疫细胞相互作用或许藏着答案。

2024年1月20日，《Nature Communications》杂志发表了由复旦大学附属中山医院樊嘉院士、周俭教授、施国明教授团队联合中科院神经科学研究所孙怡迪团队的研究成果，该研究揭示了Macro CD5L+细胞通过加剧CD8+T细胞耗竭，影响肝内胆管癌GOLP联合治疗效果，且抗CTLA4抗体可逆转耐药。今天我们就来拆解一下这篇生信文章：Macro CD5L+ deteriorates CD8+T cells exhaustion and impairs combination of Gemcitabine-Oxaliplatin-Lenvatinib-anti-PD1 therapy in intrahepatic cholangiocarcinoma。

研究概述

本研究聚焦肝内胆管癌（iCCA）的GOLP联合治疗（吉西他滨+奥沙利铂+仑伐替尼+抗PD1抗体），通过单细胞测序等技术，分析治疗前后肿瘤微环境的细胞动态变化，识别预测治疗响应的细胞亚型及分子机制，为优化iCCA治疗方案提供理论依据。

实验设计

1. 纳入临床队列（NCT03951597、FDU-ZS-iCCA-T等），收集iCCA患者治疗前后肿瘤样本及临床数据，以评估GOLP治疗疗效；
2. 构建小鼠iCCA模型来验证不同药物组合的治疗效果；
3. 对肿瘤样本进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）和T细胞受体（TCR）测序，以解析细胞组成及分子特征；
4. 结合流式细胞术、多重免疫荧光（mIHC）、细胞共培养等实验，来验证关键细胞相互作用及分子机制；
5. 通过动物实验测试抗CTLA4抗体对GOLP耐药的逆转作用。

研究结果

图1：GOLP联合治疗在临床患者和小鼠模型中均展现出高治疗效能，肿瘤缩小效果优于其他药物组合；

图2：单细胞测序鉴定出12种细胞类型，GOLP治疗后T细胞、髓系细胞和成纤维细胞比例升高，部分细胞亚型与治疗响应相关；

图3：肿瘤细胞分为4个元簇，C1（免疫应答相关）和C3（解毒相关）高评分患者对GOLP治疗响应更佳；

图4：Macro CD5L+巨噬细胞在治疗响应差的患者中比例更高，呈M2型极化和抗炎特征；

图5：基线时高比例的CD8增殖型细胞和CD8 GZMB+细胞可预测良好治疗响应，CD8 GZMK+细胞与患者预后正相关；

图6：GOLP治疗后CD8+T细胞克隆扩增，CD8增殖型细胞→CD8 GZMB+细胞→CD8 GZMK+细胞的转化与良好治疗响应相关；

图7：Macro CD5L+通过CD5L蛋白与CD8 GZMB+细胞相互作用，上调CTLA4表达加剧其耗竭；

图8：抗CTLA4抗体可逆转Macro CD5L+诱导的GOLP治疗耐药，且不依赖CD4+Treg细胞；

图9：总结关键发现，包括治疗响应预测指标、CD8+T细胞亚型转化及Macro CD5L+的作用机制。

数据分析

生信分析

涉及组学技术包括单细胞RNA测序（scRNA-seq）、T细胞受体测序（TCR-seq）和批量RNA测序（bulk RNA-seq）。

分析流程

scRNA-seq分析

• 数据预处理：过滤低质量细胞（基因数<500、线粒体RNA占比>8%等），去除双细胞，保留高变基因；
• 聚类分析：通过PCA降维，UMAP可视化，Leiden算法聚类，注释12种细胞类型及亚型；
• 差异分析：比较治疗前后、不同治疗响应组间的差异表达基因，进行功能富集分析；
• 细胞轨迹分析：使用Monocle2推断CD8+T细胞亚型的分化轨迹；
• RNA velocity分析：结合velocyto和scVelo，预测细胞亚型间的转化方向；
• 细胞间相互作用分析：利用CellChat和NATMI，预测配体-受体相互作用网络；
• 转录因子分析：通过pySCENIC识别调控CD8+T细胞亚型的转录因子。

2. TCR-seq分析

• 数据比对：将测序reads比对到GRCh38参考基因组，进行TCR注释；
• 克隆型分析：使用Scirpy定义T细胞克隆型，分析治疗前后克隆扩增、收缩及共享情况；
• 克隆型与表型关联：分析不同CD8+T细胞亚型的克隆型分布及一致性。

3. bulk RNA-seq

• 基因集变异分析（GSVA）：计算细胞亚型特征评分，评估其在批量样本中的表达水平；
• 生存分析：基于特征基因表达，分析与患者预后的相关性；
• 关联分析：构建线性回归模型，分析Macro CD5L+与CD8 GZMB+的表达相关性。

4. 组学联合分析

• 整合scRNA-seq和TCR-seq数据，关联CD8+T细胞的转录组特征与克隆型动态变化；
• 结合scRNA-seq和bulk RNA-seq数据，验证关键细胞亚型的预测价值及泛化性；
• 联合单细胞测序与mIHC、流式细胞术结果，验证细胞亚型的空间分布及表型特征。

统计分析

• 组间比较：采用t检验、Wilcoxon秩和检验、卡方检验等，比较不同组间细胞比例、基因表达及肿瘤大小变化；
• 相关性分析：使用Pearson或Spearman相关分析，评估细胞比例与肿瘤收缩率、基因表达间的关联；
• 生存分析：采用log-rank检验，比较不同特征分组患者的总生存期；
• 预测指标评估：通过构建线性回归模型，计算预测指数（Pi）和治疗指数（Ti），评估细胞亚型的预测价值；
• 统计显著性：以P<0.05为差异有统计学意义，多重检验采用Benjamini–Hochberg校正。

总结

研究意义

本研究首次揭示了Macro CD5L+巨噬细胞通过上调CD8 GZMB+细胞的CTLA4表达，加剧其耗竭，从而削弱GOLP联合治疗效果的机制；鉴定了CD8 GZMB+、CD8增殖型细胞等可预测治疗响应的细胞标志物；证实抗CTLA4抗体可逆转耐药，为iCCA的个体化治疗和方案优化提供了新靶点和新思路。